书名:精编分子生物学实验指南（精装）作者:颜子颖出版社:科学出版社出版日期:1999年1月ISBN:7030064089页数:861开本:16市场价格:￥110元会员价格:￥110元VIP价格:￥110元赠送积分:110分版次: 1浏览次数:1 《精编分子生物学实验指南》是一本集现代分子生物学最新技术的基本原理和操作方法之大成的工具书。所收入的全是十分常用的重要方法，涉及17方面的内容：大肠杆菌、质粒和噬菌体，DNA制备与分析，DNA和RNA的酶促操作，RNA的制备与纯化，重组DNA文库，重组DNA文库的筛选，DNA测序，重组DNA诱变，DNA转染哺乳动物细胞方法的介绍，蛋白质分析，免疫学，DNA-蛋白质相互作用，酿酒酵母，原位杂交与免疫组织化学，聚合酶链式反应，蛋白质表达，蛋白质磷酸化分析等。《精编分子生物学实验指南》内容新颖、丰富、实用，适用于从事生物、医 学和其他与生命科学相关的基础和应用研究的科研或教学人员。精编分子生物学实验指南目录中译本序前言第1章大肠杆菌、质粒和噬菌体1．l培养基及细菌学常用工具的准备1．1．1极限培养基1．1．2丰富培养基l．1．3固体培养基l．1．4顶层琼脂培养基1．1．5穿刺琼脂培养基1．l．6实验工具1．2在液体培养基中培养1．2．1基本方案1过夜培养l．2．2基本方案2大体积培养1．2．3基本方案3细菌培养的监测1．3在固体培养基中培养1．3．1基本方案1通过连续稀释法滴定和分离细菌菌落1．3．2基本方法2通过平板划线法分离单菌落l．3．3基本方案3通过铺平板分离单个菌落1．3．4辅助方案1影印平板1．3．5辅助方案2菌株的保存和复苏1．4经典细菌遗传学选论1．5质粒图谱1．6质粒DNA的小量制备1．6．1基本方案1碱裂解小量制备法1．6．2备择方案96孔微量滴定板碱裂解法1．6．3基本方案2煮沸小皇制备法1．6．4辅助方案质粒DNA的保存1．7质粒DNA的大量制备1．7．1粗制裂解物的制备基本方案1碱裂解法基本方案2氯化铯／澳化乙锭平衡离心法1．7．2备择方案利用离子交换层析和分子筛层析纯化质粒DNA1．8将质粒DNA导入细菌细胞1．8．1基本方案ICaCl2转化法1．8．2备择方案一步法制备和转化感受态细菌1．8．3基本方案2高效率的电转化方法1．9源于丝状噬菌体的载体1．9．l丝状噬菌体载体的发展和应用1．9．1噬菌体衍生载体的制备和应用基本方案利用辅助噬菌体从质粒制备单链DNA第2章DNA的制备和分析2．l水溶液中DNA的纯化和浓缩2．1．1基本方案DNA的酚抽提和乙醇沉淀2．1．2备择方案1异丙醇沉淀DNA2．1．3辅助方案1酚的平衡及酚／氯仿／异戊醇的配制2．1．4辅助方案2丁醇浓缩DNA2．1．5辅助方案3醚抽提法去除残存酚、氯仿或丁醇2．1．6备择方案2玻璃球法纯化DNA2．1．7备择方案3RNA及DNA稀溶液的纯化和浓缩2．1．8备择方案4乙醇沉淀法去除低分子量的寡核着酸和核着三磷酸2．2从哺乳动物组织中制备基因组DNA基本方案2．3从植物组织中制备基因组DNA2．3．1基本方案氯化铯离心法制备植物DNA2．3．2备择方案用CTAB制备植物DNA2．4从细菌中制备基因组DNA2．4．1基本方案细菌基因组DNA的小量制备2．4．2备择方案氯化铝法大规模制备细菌基因组DNA2．4．3辅助方案从所得到的基因组DNA制备物中除去多糖2．SA琼脂糖凝胶电泳2．5AI基本方案大片段DNA在琼脂糖凝胶上的分离2．5A．2辅助方案微型凝胶及中型凝胶2．5B脉冲场凝胶电泳2．5B．l基本方案倒转电场凝胶电泳2．5B2备择方案错位均匀电场电泳（CHEF电泳）2．5B．3辅助方案高分子量DNA样品和分子量标准物的制备2．6从琼脂糖凝胶中分离和纯化大的DNA限制性酶切片段2．6．l基本方案1琼脂糖凝胶电洗脱2．6．2基本方案2NA－45纸电泳263基本方案3用低熔点琼脂糖凝胶分离DNA片段2．6．4备择方案1使用B琼脂糖酶消化法从低熔点琼脂糖凝胶中回收DNA2．6．5备择方案2用玻璃珠法从低熔点琼脂糖凝胶中回收DNA2．6．6辅助方案用溴化乙锭斑点定量法对DNA浓度进行快速估测2．7非变性聚丙烯酸胺凝胶电泳2．7．1基本方案2．7．2备择方案1通过电洗脱从聚丙烯酸胺凝胶纯化片段2．7．3备择方案2DEAE膜电洗脱法纯化标记片段2．7．4辅助方案可重复使用的用于凝胶加样的塑料毛细管2．8筛分型琼脂糖凝胶电泳基本方案2．9ASouthern印迹法2．9A1基本方案用高盐缓冲液在尼龙股或硝酸纤维素膜上进行Southern印迹2．9A2辅助方案紫外透射仪的校准2．9A3备择方案1用碱性缓冲液在尼龙膜上进行Southern印迹2．9A4备择方案2用向下毛细管转移法进行Sauthern印迹2．9A5备择方案3从聚丙烯酸胺凝胶至尼龙膜的电转印法2．9BDNA的斑点和狭线印迹2．9B．1基本方案用多样抽滤加样器在不带电荷的尼龙膜和硝酸纤维素膜上进行DNA斑点和狭统印迹2．9B．2备择方案1用多样抽滤加样器在带正电荷的尼龙膜上进行DNA斑点和狭线印迹2．9B．3备择方案2DNA斑点印迹的手工制备210DNA印迹的杂交分析2．10．1基本方案放射性标记的DNA探针对DNA印迹的杂交分析2．10．2备择方案用放射性标记的RNA探针对DNA印迹进行杂交分析2．10．3辅助方案从杂交膜上除去探针2．11变性聚丙烯酸胺凝胶电泳纯化寡核着酸基本方案第3章DNA和DRNA的酸学操作3．1限制性内切酶消化DNA3．1．1基本方案单酶单DNA样品消化3．1．2备择方案1多限制性内切酶消化DNA样品3．1．3备择方案2消化多个DNA样品3．1．4备择方案3限制性内切酶对DNA样品的部分消化3．1．5辅助方案DNA的甲基化3．2用多种酶消化进行DNA作图基本方案3．3用限制酶部分消化进行DNA作图基本方案3．4核酸操作的常用试剂和放射性同位素3．4．l贮液3．4．210X酶缓冲液3．4．3酶反应条件及应用3．4．4核苷三磷酸（NTP）3．4．5标记核酸的放射性同位素基本方案酸沉淀法测定DNA和RNA中的放射性备择方案柱离心法分离放射性标记DNA3．5依赖于DNA的DNA聚合酶3．51大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段基本方案1标记DNA的3末端基本方案2修复突出的3或5末端以产生平端基本方案3随机寡核着酸引物介导的DNA标记Klenow酶的其他应用3．5．2T4DNA聚合酶3．5．3天然T7DNA聚合酶3．5．4经修饰的T7DNA聚合酶3．5．sTaqDNA聚合酶3．6不依赖于模板的DNA聚合酶末端脱氧核着酸转移酶（末端转移酶）37依赖RNA的DNA聚合酶反转录酶3．8依赖DNA的RNA聚合酶．噬菌体的RNA聚合酶：SP6、T7和T33．9不依赖DNA的RNA聚合酶POly（A）聚合酶3．10磷酸酶和激酶3．10．1碱性磷酸酶3．10．2T4多核着酸激酶基本方案1正向反应标记5端基本方案2交换反应标记5端其他应用3．11外切核酸酶3．11．l单链5一3和3一5外切核酸酶3．11．2双链5一3味端外切核酸酶3．11．3双链3一5外切核酸酶3．12内切核酸酶．3．12．1Bal31核酸酶．3．12．2SI核酸酶3．12．3绿豆核酸酶3．12．4微球菌核酸酶3．12．5脱氧核糖核酸酶1（DNaseI）．3．13核糖核酸酶．3．13．1核糖核酸酶A（RNaseA）．3．13．2核糖核酸酶H3．13．3核糖核酸酶T13．14DNA连接酶3．141T4DNA连接酶3．14．2大肠杆菌DNA连接酶3．15RNA连接酶T4RNA连接酶3．16DNA片段的亚克隆3．161基本方案3．16．2备择方案凝胶块中DNA片段的连接3．17聚合酶链式反应构建重组DNA基本方案DNA片段亚克隆3．18非同位素探针的标记和比色检测3．18．l基本方案1用切口平移法制备生物素酸化的探针3．18．2基本方案2用随机寡核青酸引物合成法制备生物素酸化探针3．18．3辅助方案生物素酸化探针的比色法检测3．18．4备择方案制备和检测地高辛标记的DNA探针f3．19非同位素探针的化学发光检测3．19．1基本方案生物素标记探针的化学发光检测＠3．19．2备择方案地高辛标记探针的化学发光检测3．19．3辅助方案紫外光源的标化第4章RNA的制备和分析4．l从组织培养细胞中提取细胞质RNA4．1．1基本方案4．1．2辅助方案除去混杂的DNA污染4．2异硫氰酸弧法制备总RNA4．2．l基本方案CaCl法纯化从培养细胞中提取的RNA4．2．2备择方案1CaCl纯化组织RNA4．2．3备择方案2从组织或培养细胞中一步法分离RNA4．3酚／SDS法制备植物RNA基本方案4．4制备细菌RNA4．4．1基本方案1从革兰氏阴性细菌中分离高质量的RNA4．4．2基本方案2从革兰氏阳性细菌分离RNA4．4．3备择方案从革兰氏阴性菌中快速分离RNA4．5paly（A）+RNA的制备基本方案4．6用单链DNA探针进行mRNA的S1核酸酶作图分析4．61基本方案用MI3模板进行mRNA的S1作图4．62备择方案1从双链模板合成单链探针4．6．3备择方案2用寡核着酸探针进行mRNA的定量S1作图分析4．6．4辅助方案SI核酸酶mRNA定量分析的实验对照4．7核酸酶保护试验4．7．1基本方案4．7．2辅助方案1RNA探针的提纯4．7．3辅助方案2模板DNA的制备4．8引物延伸基本方案4．9RNA的Narthern印迹和狭线杂交分析4．9．l基本方案甲醛一琼脂精凝胶电泳分离RNA的Narthern杂交，4．9．2备择方案1经戊二醛／二甲基亚矾变性处理的RNA的Narthern杂4．9．3备择方案2经狭线印迹固定的未分级RNA样品的Northern杂交第5章重组DNA文库的构建5．1基因组DNA文库概述5．1．1表现度与随机性5．1．2亚基因组文库5．1．3基因组DNA文库载体5．2cDNA文库概述5．3噬菌体文库的扩增基本方案5．4粘粒和质粒文库的扩增 基本方案第6章重组DNA文库的筛选6．1噬菌体文库的铺平板和转移基本方案6．2粘粒及质粒文库的铺平板和转移基本方案6．3应用DNA片段作探针6．3．l基本方案在甲酸胺溶液中进行杂交6．3．2备择方案在水溶液中进行的杂交6．4使用合成寡核着酸作探针6．4．1基本方案1在氯化钠／柠檬酸钠溶液（SSC）中杂交6．4．2基本方案2在氯化四甲铵（TMAC）中杂交6.4.3辅助方案混合寡核苷酸5末端标记6．5噬菌体克隆的纯化基本方案6．6粘粒和质粒克隆的纯化基本方案6．7在人噬菌体噬斑中产生的融合蛋白的免疫筛选6．7．1基本方案用抗体筛选人gtll表达文库6．7．2备择方案在抗体筛选之前用IPTG诱导融合蛋白表达6．8在杂交选择和翻译后进行的免疫筛选某本方案6．9概述筛选YAC文库和分析YAC克隆的策略6．9．1YAC文库的构建6．9．2中心实验室的YAC文库筛选6．9．3筛选用的基因座特异性PCR试验的设计6．9．4分析独立的YAC克隆6．9．5YAC插入片段的亚文库的构建与分析6．10对分离得到的YAC克隆的分析6．10．l基本方案1含YAC的酵母菌株的培养和保存6．10．2基本方案2制备YACDNA进行Southern印迹分析6．10．3基本方案3制备用于脉冲电场凝胶电泳的包理于琼脂糖胶块中的酵母染色体6．10．4基本方案4用PCR扩增法进行末端片段分析6．10．5备择方案采用亚克隆至细菌质粒载体中分析末端片段6．10．6辅助方案设计和制备pUC19－ES和pUC19－HS亚克隆载体6．10．7基本方案5制备高分子量的含YAC的酵母DNA6．10．8基本方案6制备和分析YAC插入片段的亚文库7．0DNA测序方法概述．7．0．1双脱氧测序（Sanger法）7．0．2化学测序（Maxam－Gi比ert法）7．0．3双脱氧法或化学测序法的选择7．0．4放射性标记测序反应的备择标记7．1DNA测序策略．；7．1．l双脱氧测序．；7．1．2化学测序7．2构建用于DNA测序的嵌套式缺失突变体7．2．l基本方案1用外切酶Ill构建单向缺失突变体7．2．2辅助方案1用[a－35]dNTP使DNA免于外切酶III消化7．2．3基本方案2用Ba131核酸酶构建嵌套式缺失突变体7．2．4辅助方案制备M13mp测序载体以亚克隆Ba131消化的DNA片段7．3制备DNA测序模板7．3．1基本方案1制备单链M13噬菌体DNA7．3．2基本方案2从小量裂解物中制备人噬菌体DNA7．3．3基本方案3小量制备用于双脱氧测序的双链质粒DNA模板7．3．4基本方案4用于双脱氧测序的双链质粒DNA的碱变性7．3．5基本方案5制备用于热循环测序质粒或噬菌体DNA7．4双脱氧法DNA测序7．4．l基本方案1用测序酶进行标记／终止测序反应7．4．2备择方案1使用Mn2+的标记／终止反应7．4．3备择方案2使用TaqDNA聚合酶进行Sanger双脱氧测序7．4．4备择方案3用5末端标记引物一步法进行测序反应7．4．5基本方案2用标记核昔酸进行热循环测序反应7．4．6备择方案4用5末端标记引物进行热循环测序反应7．5化学发光双脱氧DNA测序法7．5．1基本方案利用生物素标记引物的化学发光DNA测序法7．5．2备择方案1链亲和素和生物素酸化碱性磷酸酶两步检测法（间接法）7．5．3备择方案2用半抗原标记引物进行测序并用抗体碱性磷酸酶偶联物进行检测7．6用于测序的变性凝胶电泳7．6．1基本方案测序胶的灌制、电泳及处理7．6．2备择方案l缓冲液梯度测序胶7．6．3备择方案2电解质梯度测序胶7．6．4备择方案3含甲酸胺的测序胶－7．7DNA和蛋白质序列的计算机处理和分析7．7．1序列数据的录入7．7．2序列数据的确证和组装7．7．3限制酶作图 7．7．4核酸结构预测7．7．5寡核着酸设计策略7．7．6蛋白质编码区的识别7．7．7同源性检索7．7．8向分子生物学家提供的基因序列库及其他计算机资源附录第8章克隆化DNA的诱变8．1无需表型选择的寡核苷酸介导的诱变基本方案8．2A用简并寡核苷酸诱变：在小段DNA序列中产生大量突变基本方案8．ZB基因合成：用互为引物的长段寡核着酸合成目的序列基本方案8．3区域特异性诱变8．3．1基本方案8．3．2辅助方案突变克隆的富集8．4DNA的接头分区诱变8．4．l辅助方案用嵌套缺失体和互补寡核着酸进行接头分区诱变8．4．2备择方案寡核着酸介导的接头分区诱变8．5利用聚合酶链式反应（PCR）的定点诱变8．5．l基本方案1通过PCR引人限制性内切酶位点8．5．2基本方案2利用PCR引入点突变8．5．3备择方案通过顺序PCR步骤引入点突变 第9章DNA导入哺乳动物细胞 9．1磷酸钙转染法9．1．l基本方案磷酸钙-DNA在HEPES中形成沉淀的转染方法9．1．2辅助方案l哺乳动物细胞的甘油／二甲基亚砜7休克9．1．3备择方案在BES中形成磷酸钙-DNA沉淀的高效转染方法9．1．4辅助方案2质粒DNA的纯化9．2利用DEAE-葡聚精的转染9．2．1基本方案9．2．2备择方案1DEAE-葡聚糖大批量转染9．2．3备择方案2悬浮细胞的转染9．2．4备择方案3用氯险处理细胞9．3电穿孔转染法9．3．l基本方案电穿孔法转染哺乳动物细胞9．3．2备择方案植物原生质体细胞的电穿孔转染9．4脂质体介导的转染9．4．l基本方案用脂质体介导短暂表达9．4．2备择方案用脂质体进行稳定转染9．5将基因稳定转染至哺乳动物细胞9．5．l基本方案9．5．2哺乳动物细胞的选择标记9．6遗传报道基因系统概述9．6．l报道载体的设计9．6．2体外报道分子分析方法9．63体内报道分子分析方法9．7A报道基因活性的同位素分析方法9．7A．1基本方案1CAT活性的层析分析法9．7A．2备择方案1原位裂解细胞的CAT分析方法9．7A．3备择方案2CAT活性的相一抽提分析法9．7A．4基本方案2人生长激素的放射免疫分析法9．7B非同位素分析报道基因活性9．7B．l基本方案1萤火虫荧光素酶报道基因分析9．7B．2备择方案冻融裂解的细胞的荧光素酶分析9．7B．3基本方案2b-半乳精着酶报道基因的化学发光分析9．8转染后RNA的直接分析9．8．l转染效率9．8．2RNA制备9．8．3RNA分析9．8．4启动子强度9．9转染条件的优化9．9．1DEAE-葡聚糖转染法9．9．2磷酸钙转染法9．9．3电穿孔法9．9．4脂质体介导的转染9．10反转录病毒转导系统概述9．10．1反转录病毒生活周期9．10．2无复制能力的载体9．103有复制能力的载体9．10．4包装细胞系和病毒的产生9．10．5安全性问题9．11建立特异的反转录病毒产毒细胞系9．11．l基本方案1将反转录病毒载体导入包装细胞系gll．2基本方案2测定病毒滴度：高滴度产病毒细胞克隆的鉴定9．11．3备择方案产毒克隆的快速评价9．11．4辅助方案培养细胞的Xgl染色9．12大规模制备和浓缩反转录病毒原液9．12．l基本方案用离心法制备和浓缩病毒原液9．12．2备择方案用聚乙二醇均相沉淀及层析法浓缩病毒．．9．12．3备择方案用分子量截留滤膜进行浓缩9．13反转录病毒原液中辅助病毒的检测9．13．l基本方案通过药物抗性的水平传播分析辅助病毒9．13．2备择方案用反转录酶分析法检测辅助病毒9．14用反转录病毒在体外及体内感染细胞9．14．1体外细胞感染9．14．2在体内感染啮齿类动物第互0章蛋白质的分析10．1比色法测定蛋白质含量．基本方案Bradford法10．2蛋白质的单向SDS凝胶电泳10．2．l电与电泳10．2．2基本方案1变性（SDS）不连续凝胶电泳：Laemmh凝胶电泳法10．23备择方案1在Tris－Tricine缓冲系统中电泳10．2．4备择方案2在无尿素条件下用Tris缓冲液分离多肽10．2．5备择方案3连续SDS聚丙烯酸胺凝胶电泳102．6备择方案4超薄凝胶的灌制和电泳10．2．7辅助方案1一次灌制多块浓度均一的凝胶10．2．8备择方案5在梯度凝胶中分离蛋白质102．9辅助方案2一次灌制多块梯度胶10．2．10基本方案2在均一浓度的微型凝胶上电泳10．2．11辅助方案3制备多块梯度胶10．3使用OFarrell系统的双向凝胶电泳10．3．l基本方案1第l向凝胶（等电聚焦）10．3．2基本方案2第2向凝胶10．3．3备择方案1、2（第1向凝胶电泳）极端碱性、酸性蛋白的等电聚焦10．3．4备择方案3小型凝胶双向电泳10．3．5辅助方案组织来源的蛋白质样品的溶解和制备10．4从已染色的凝胶中电洗脱回收蛋白质基本方案10．5凝胶中蛋白质的染色1051基本方案1考马斯亮蓝染色10．5．2基本方案2银染法10．5．3备择方案非氨盐银染法10．5．4基本方案3快速银染法10．5．5辅助方案凝胶拍照10．6检测转印到股上的蛋白质10．6．l基本方案印度墨汁染色10．6．2备择方案金染色10．6．3辅助方案碱处理增强蛋白质的染色10．7免疫印迹与免疫检测10．7．1基本方案1用转移槽转印蛋白质10．7．2备择方案1用半干转移系统转印蛋白质10．7．3辅助方案转印后蛋白质的可逆染色10．7．4基本方案2用第H抗体偶联物进行免疫检测10．7．5备择方案2用亲和素一生物素偶联的第二抗体进行免疫检测10．7．6基本方案3用发色底物显迹10．7．7备择方案3用发光底物显迹10．8凝胶过滤层析10．8．1基本方案蛋白质的凝胶过滤分离10．8．2备择方案蛋白质的凝胶过滤脱盐10．8．3辅助方案凝胶介质和层析柱的选择10．9离子交换层析10．9．l基本方案10．9．2辅助方案离子交换层析介质和层析柱的选择10．10免疫亲和层析10．10．1基本方案可溶性抗原或膜结合抗原的分离10．10．2备择方案1抗原的批处理纯化10．10．3备择方案2低pH洗脱抗原10．11金属螫合亲和层析10．11．l基本方案天然MCAC纯化带组氨酸尾的可溶性融合蛋白10．11．2备择方案1变性条件下用MCAC纯化带组氨酸尾的不溶性融合蛋白10．11．3备择方案2MCAC纯化蛋白的固相复性10．11．4辅助方案1已纯化蛋白的分析和处理10．11．5辅助方案2NTA介质的再生10．12反相高效液相层析10．12．l基本方案多肽和蛋白质的分离10．12．2备择方案蛋白质的分离10．12．3辅助方案水、缓冲液和溶剂的脱气10．13离子交换高效液相层析10．13．l基本方案1阴离子交换HPLC10．13．2基本方案2阳离子交换HPLC10．14分子排阻高效液相层析基本方案10．15免疫沉淀法10．15．l基本方案用抗体一SePharose偶联物免疫沉淀放射性标记抗原10．15．2辅助方案制备抗体一Sepharose偶联物10．15．3备择方案1用抗Ig血清免疫沉淀放射性标记抗原10．15．4备择方案2用抗Ig抗体一SePharosc、蛋白A-或蛋白G－Sepharose或金黄色葡萄球菌（S．aureus）免疫沉淀放射性标记抗原10．15．5备择方案3使用更剧烈的解离和洗涤条件的免疫沉淀10．15．6备择方案4用抗体七ePharose琼脂精偶联物免疫沉淀非标记抗原10．16克隆化基因的体外转录和翻译基本方案10．17蛋白质的生物合成标记、10．17．1基本方案用［ S]甲硫氨酸短时间标记悬液中的细胞10．17．2备择方案1用［S]引甲硫氨酸短时间标记贴壁培养细胞10．17．3备择方案2用［S甲硫氨酸长时间标记细胞10．17．4备择方案3用［ S]甲硫氨酸对细胞进行脉冲追踪标记10．17．5备择方案4用其他氨基酸进行生物合成标记10．17．6辅助方案TCA沉淀法确定放射性标记的掺入量10．18分离蛋白质用于微量序列分析10．181基本方案1测定在PVDF膜上样品的氨基酸序列10．18．2辅助方案SDS－PAGE准备蛋白质样品10．18．3基本方案2测定N-末端封闭蛋白质的内部序列第11章免疫字11．1酶与抗体的偶联11．1．l基本方案辣根过氧化物酶（HRPO）与抗体的偶联11．1．2备择方案碱性磷酸酶与抗体的偶联11．2酶联免疫吸附测定（ELISA）11．2．l基本方案用间接ELISA法检测特异性抗体11．2．2备择方案1直接竞争ELISA法检测可溶性抗原11．2．3备择方案2抗体夹心ELISA法检测可溶性抗原11．2．4备择方案3双抗体夹心ELISA法检测特异性抗体11．2．5备择方案4直接细胞ELISA法检测细胞表面抗原11．2．6备择方案5间接细胞ELISA法检测对表面抗原具有特异性的抗体11．2．7辅助方案l交叉连续稀释法确定最佳试剂浓度11．2．8辅助方案2制备细菌细胞裂解物抗原11．3单克隆抗体上清液和腹水的制备11．3．1基本方案1单克隆抗体上清的制备11．3．2备择方案1单克隆抗体上清的大量制备11．3．3备择方案2大量制备杂交瘤或细胞系11．3．4基本方案2含单克隆抗体的腹水的制备 11．4单克隆抗体的纯化11．4．1基本方案用蛋白A－SephArOsc进行纯化11．4．2备择方案1蛋白A－SePhArOse的备择缓冲液系统11．4．3备择方案2用抗原一SePhArOse和抗鼠Ig－SePhArOsc进行纯化11．5兔多克隆抗血清的制备11．5．l基本方案肌肉内注射免疫法11．5．2备择方案1皮内注射免疫法11．5．3备择方案2皮下组织注射免疫法11．5．4备择方案3耳动脉放血11．6从抗血清、腹水或杂交瘤上清液中纯化IgG抗体11．6．1基本方案用硫酸铰沉淀IgG11．6．2备择方案用DEAE－Affi－Gel－Blue层析法分级分离IgG11．7免疫原性肽的选择11．8抗肽抗体的制备11．8．墓基本方案通过化学偶联法用MBS将合成肽偶联到担体蛋白上11．8．2备择方案用戊二醒将合成肽通过化学偶联法偶联到担体蛋白质上第12章DNA-蛋白质相巨作用12．1从哺乳动物细胞中制备核提取物和细胞质提取物12．1．1基本方案核提取物的制备12．1．2辅助方案1细胞核提取方法的优化12．1．3辅助方案2细胞质（S－100）组分的制备12．2DNA结合蛋白在凝胶电泳中的迁移率变动分析12．2．1基本方案低离子强度聚丙烯酸胺电泳迁移率变动分析12．2．2备择方案高离子强度聚丙烯酸胺电泳迁移率变动分析12．3甲基化干扰分析法和尿嘧啶干扰分析法12．3．l基本方案1甲基化干扰分析法12．3．2基本方案2尿嘧啶干扰分析法12．4DNA酶I足迹分析法12．4．1基本方案DNA酶1足迹分析法12．4．2辅助方案用光密度及数值分析法决定蛋白质结合的平衡常数12．4．3备择方案粗制品的DNA酶1足迹分析法12．5蛋白质与核酸的紫外交联12．5．l基本方案用澳脱氧尿苷（BrdU）取代的探针进行紫外交联12．5．2备择方案1用非澳脱氧尿苷（NON－BrdU）取代的探针进行紫外交联12．5．3备择方案2原位紫外交联12．6用生物素／链亲和素亲和系统纯化DNA结合蛋白12．6．1基本方案12．6．2备择方案1用微型柱进行纯化12．6．3备择方案2用链亲和素-琼胀糖进行纯化12．7编码DNA结合蛋白的cDNA的检测、纯化和鉴定12．7．1基本方案用识别位点DNA筛选gtll表达文库12．7．2备择方案干燥膜的变性／复性12．7．3辅助方案从重组溶原菌中制备粗提物鉴定DNA结合蛋白的活性12．8用体外合成的蛋白质分析DNA蛋白质相互作用基本方案12．9序列特异性DNA结合蛋白的亲和层析纯化12．9．1基本方案1DNA亲和介质的制备12．9．2备择方案将DNA偶联于渍化氰活化琼脂精上12．9．3辅助方案1用制备性凝胶电泳纯化寡核苷酸12．9．4基本方案2DNA亲和层析法12．9．5辅助方案2非同位素竞争性DNA的选择和制备第13章酿酒酵母．；13．1酵母菌培养基的制备13．1．1液体培养基13．1．2固体培养基13．1．3菌株的保存与复苏 基本方案冷冻菌种保存液的制备与接种13．2酵母菌的培养与操作13．2．1基本方案1液体培养基培养酵母菌13．2．2基本方案2固体培养基培养酵母菌13．2．3基本方案3细胞密度检测13．2．4基本方案4影印平板检测酵母菌表型13．2．5基本方案5H倍体细胞的构建13．2．6基本方案6Th倍体细胞的泡子形成13．2．7基本方案7四分体的制备与剖分13．2．8辅助方案解剖针的制作13．2．9备择方案随机炮子分析13．3酵母菌细胞的诱变13．3．1基本方案甲乙硫醚诱变13．3．2备择方案紫外光诱变13．4酵母菌的克隆载体与基因图谱13．4．l质粒分类命名13．4．2精选的质粒和基因图谱，13．5酵母菌表达载体13．6酵母菌载体与表达产物的检测13．6．1基本方案1研究基因调控的切cZ融合载体13．6．2基本方案2卜半乳糖着酶在液体培养基中的表达与检测13．7将DNA导入酵母菌细胞中13．71基本方案乙酸锂转化13．7．2备择方案1原生质体转化13．7．3备择方案2电穿孔转化13．74辅助方案单链高分子量的担体DNA的制备13．8利用互补作用克隆酵母菌基因基本方案13．9酵母细胞的质粒分离除去基本方案13．10克隆化酵母DNA的操作13．10．1基本方案1整合性转化 13．10．2基因置换技术基本方案2整合性破坏 基本方案3基因破坏一步法基本方案4移换13．10．3基本方案5质粒缺口修复13．10．4基本方案6穿梭质粒13．11酵母DNA的制备13．11．1基本方案从酵母菌中快速分离质粒DNA1311．2备择方案酵母染色体DNA的快速分离13．12酵母菌RNA的制备13．12．1基本方案热酸性酚抽提法制备酵母RNA13．12．2备择方案1玻璃珠法制备RNA13．12．3备择方案2paly（A）+RNA的制备13．13制备酵母蛋白抽提物．13．13．l基本方案原生质体制备及裂解13．13．2辅助方案差速离心法制备细胞核13．13．3备择方案1玻璃球破细胞法13．13．4备择方案2液氮破细胞法13．14利用相互作用阱／双杂合系统确定相互作用的蛋白质13．14．1基本方案1鉴定诱饵蛋白的特性13．14．2基本方案2相互作用蛋白的捕获13．14．3辅助方案1制备鲑精担体DNA13．14．4辅助方案2附加的特异性筛选方法第14章原位杂交和免疫组织化学14．1组织、胚胎及单细胞的固定、包理及切片14．1．l基本方案组织和胚胎的多聚甲醛固定及石蜡包理14．1．2备择方案悬浮及培养细胞的PFA固定14．1．3辅助方案1成年小鼠的灌流14．1．4辅助方案2蜡块中样品的切片14．1．5辅助方案3预包被载玻片的处理14．2冰冻切片14．2．l基本方案样品制备及切片14．2．2辅助方案1用于原位杂交的冰冻切片的固定14．2．3辅助方案2组织固定和蔗糖浸制14．3细胞RNA的原位杂交174．3．l基本方案石蜡切片或细胞的杂交实验14．3．2备择方案冰冻切片的杂交实验14．3．3辅助方案lS标记的核糖核酸探针和含硫探针竞争剂护14．3．4辅助方案2S标记的双链DNA探针的合成14．4杂交探针的检测14．4．l基本方案1胶片放射自显影14．4．2基本方案2胶乳放射自显影14．4．3辅助方案放射自显影用稀释胶乳的制备14．5放射自显影原位杂交玻片的复染和压片固定14．5．l基本方案吉姆萨（Giemsa）染色法14．5．2备择方案1苏木精／伊红染色法14．5．3备择方案2甲苯胺蓝染色法14．5．4备择方案3HOECHST染色法14．6免疫组织化学法14．6．1基本方案l单层生长细胞的免疫荧光标记14．6．2备择方案1悬浮细胞的免疫荧光标记14．6．3基本方案2组织切片的免疫荧光标记14．6．4备择方案2链亲和素一生物素结合物免疫荧光标记法14．6．5备择方案3组织切片的免疫金标记14．6．6备择方案4组织切片的免疫过氧化物酶标记14．6．7备择方案5组织切片的免疫荧光双标记法14．7用非同位素探针进行原位杂交和检测14．7．l基本方案1荧光原位杂交14．7．2杂交信号的放大辅助方案1生物素酸化信号的放大辅助方案2地高辛标记探针的信号放大14．7．3非同位素标记探针的酶法检测备择方案1辣很过氧化物酶法检测备择方案2碱性磷酸酶检测法14．8低丰度核酸的检测：原位PCR和杂交14．8．l总体设计14．8．2基本方案1DNA和RNA靶序列的原位PCR扩增14．8．3备择方案一步法反转录及扩增14．8．4基本方案2ISPCR扩增的产物的杂交和检测14．8．5辅助方案1AES浸泡处理载玻片的制备14．8．6辅助方案2在载玻片上制备康位PCR样品14．8．7辅助方案3用P标记寡核苷酸探针第互5章聚合酶链式反应（PCR）15．1PCR扩增DNA：标准程序和优化基本方案15．2利用PCR产物直接进行DNA序列测定15．2．1基本方案1不对称PCR产生的单链产物的双脱氧测序15．2．2备择方案1单引物重复扩增制备单链模板以用于双脱氧测序15．2．3备择方案2制备用于双脱氧测序的双链PCR产物15．2．4备择方案3用人噬菌体核酸外切酶消化双链PCR产物得到单链进行双脱氧测序15．2．5基本方案2PCR产物的标记和化学测序15．2．6备择方案4PCR产物的基因组测序15．3通过PCR方法对微量DNA进行定量分析基本方案15．4PCR扩增RNA15．4．l基本方案在最适条件下进行RNA的PCR扩增15．4．2备择方案1避免长时间的共沉淀及退火步骤的方法15．4．3备择方案2将cDNA直接用于扩增反应15．4．4辅助方案粗制RNA的快速提取15．5用于基因组测序及足迹分析的连接介导PCR15．5．l基本方案连接介导的单侧PCR15．5．2辅助方案1从单层细胞制备基因组DNA以用于DMS足迹分析15．5．3辅助方案2从悬浮细胞中制备用于DMS足迹分析的基因15．5．4辅助方案3用于化学测序的基因组DNA的制备15．6利用单侧PCR（铺式PCR）进行cDNA扩增15．6．1基本方案1扩增已知序列的下游（端）区段15．6．2基本方案2扩增已知序列上游（5端）区段15．7PCR产物的分子克隆15．7．l基本方案产生T－A突出端15．7．2备择方案1产生半位点15．8通过PCR差异展示mRNA基本方案第16章蛋白质的表达16．1概述：蛋白质在大肠杆菌中表达16．1．1用大肠杆菌进行基因表达的一般策略16．1．2特定的表达方案16．1．3基因表达的疑难分析16．2T7RNA聚合酶／启动子表达系统16．2．1基本方案用双质粒系统进行表达16．2．2备择方案1质粒编码蛋白的选择性标记16．2．3备择方案2通过M13噬菌体mGP1-2感染的表达16．3用带入噬菌体调节序列的载体进行表达16．3．1基本方案1基因表达的温度诱导16．3．2基本方案2基因表达的化学诱导16．3．3辅助方案1用pSKF系列载体进行天然基因克隆16．3．4辅助方案2融合基因在PSKF301中的构建和拆分16．4融合蛋白载体表达概述16．4．1表达蛋白的可溶性16．4．2表达蛋白的稳定性16．4．3裂解融合蛋白以除去担体蛋白16．5融合蛋白的酶解和化学裂解16．5．l基本方案1用Xa因子进行融合蛋白的酶解16．5．2辅助方案用Xa因子进行变性融合蛋白的裂解16．5．3备择方案1用凝血酶进行融合蛋白的酶解16．5．4备择方案2与分离介质结合的GST融合蛋白的酶解16．5．5备择方案3用肠激酸进行融合蛋白的酶解16．5．6基本方案2用溴化氰对融合蛋白进行化学降解16．5．7备择方案4用羟胺化学裂解融合蛋白16．5．8备择方案5低PH下水解融合蛋白进行化学裂解16．6lacZ和trpE融合蛋白的表达及纯化基本方案16．7谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白的表达及纯化基本方案16．8硫氧还蛋白融合蛋白的表达和纯化16．8．1基本方案硫氧还蛋白融合蛋白的构建和表达16．8．2辅助方案1用弗氏细胞压碎器裂解大肠杆菌16．8．3辅助方案2硫氧还蛋白融合蛋白的渗透性释放16．8．4辅助方案3用热处理纯化硫氧还蛋白融合蛋白16．9杆状病毒表达系统的概述16．9．l杆状病毒表达系统16．9．2昆虫细胞中蛋白质的翻译后修饰16．9．3用杆状病毒表达系统超量表达蛋白的步骤16．9．4用于杆状病毒表达系统的试剂、溶液和设备16．10昆虫细胞培养物及杆状病毒毒种贮液的制备16．10．l基本方案1昆虫细胞的保存和培养1610．2基本方案2杆状病毒毒种贮液的制备16．10．3辅助方案用蚀斑试验测定病毒贮液的滴度，16．11重组杆状病毒的产生和重组蛋白的表达分析16．11．1基本方案1用野生型病毒线性化DNA共转染16．11．2备择方案用野生型病毒环状DNA共转染16．11．3辅助方案1野生型杆状病毒的纯化16．11．4基本方案2编码b-半乳糖甘醇的重组杆状病毒的纯化16．11．5辅助方案2裸眼筛选重组杆状病毒16．11．6基本方案3重组病毒的蛋白质分析16．11．7辅助方案3重组蛋白质的代谢标记16．11．8辅助方案4蛋白质生产高峰期的确定16．11．9基本方案4重组蛋白质的大规模生产16．12概述：蛋白质在哺乳动物细胞中表达16．12．l病毒介导的基因转移16．12．2短暂表达16．12．3DNA的稳定转染16．12．4转染DNA的扩增16．12．5表达载体16．12．6表达系统的选择16．12．7问题的发现与解决16．13用COS细胞短暂表达蛋白质基本方案第17章蛋白质磷酸化的分析17．1蛋白质磷酸化概述17．2培养细胞用于；标记和用于免疫沉淀的细胞裂解物的制备17．2．1基本方案培养细胞的P1标记和温和去污剂裂解法17．2．2备择方案SDS煮沸法裂解细胞17．3磷酸氨基酸分析17．3．1基本方案磷酸氨基酸的酸水解和双向电泳分析17．3．2备择方案碱处理提高转移至滤膜上的磷酸酪氨酸和磷酸苏氨酸的检测17．4分析非标记蛋白质的磷酸化作用17．4．l基本方案1用抗磷酸酪氨酸抗体和[I]标记蛋白A进行免疫印迹分17．4．2备择方案用增强化学发光洁（ECL）检测结合的抗体17．4．3基本方案2磷酸酶消化法鉴定磷酸化的蛋白质附录附录1试剂和溶液附录2标准测量值、数据和缩写常用缩写实用测量值和数据核酸的特性放射性离心机和转子附录3生物化学和分子生物学常用技术，附录3A放射自显影附录3B玻璃器皿的硅化附录3C透析与超滤附录3D用吸收光谱法和荧光光谱法定量DNA和RNA附录3E通过沉默突变引入限制性酶切位点附录4试剂和设备的供应商附录5参考文献致谢